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实验室规程

细胞培养无菌操作实验室规程

发布时间:2011-04-18 22:08:01    阅读次数:1616  

一、日常管理工作:

1、准备工作:实验前,准备齐当天所用物品(包括废液缸),并配制2%新洁尔灭溶液(3000mL)及空盆于无菌间,开操作台和无菌室紫外灯30min。放臭氧15min后,再进无菌间操作。

2、无菌间操作:进入无菌间后换拖鞋、穿工作服、戴口罩、帽子、手套,然后用新洁尔灭洗手;将所用的试剂用新洁尔灭或75%酒精擦拭后放入操作台,撕封口膜,用酒精棉球擦拭瓶口,再在酒精灯火焰上烤,之后用止血钳夹住瓶塞取下;在操作台内,瓶口尽量不应直立向上,在盖塞前烤塞子与瓶口(除酒精棉球瓶外),再盖严加封口膜取出;做完实验,清理操作台,用新洁尔灭擦拭台面及操作台上的物品。

3、无菌间卫生:无菌室每周要彻底打扫一次,用新洁尔灭擦墙、门、仪器及桌面等;75%酒精擦窗、玻璃等;过氧乙酸擦操作台、出问题或准备要用的培养箱。

4、无菌服: 一次性使用的隔离服用完进行毒处理后再弃。

 

二、实验室物品处理:

1、新塞子的处理方法:新胶塞对细胞有一定的毒害作用,其处理方法为:新胶塞 →洗衣粉洗→洗涤灵洗→晾干→20g/1000mL的NaOH煮30min(沸腾起计时)→水冲洗→去离子水浸泡过夜→双蒸水冲洗→晾干→备用。

2、直接接触细胞用品的处理 用品→过氧乙酸浸泡过夜(20mL/10000mL过氧乙酸)→取出→洗涤灵擦洗→水冲→晾干→泡酸(洗液)→自来水浸泡过夜→去离子水冲洗→双蒸水冲洗→晾干→备用。

3、不直接接触细胞用品的处理 用品→自来水冲洗(可适当用洗衣粉或洗涤灵洗)→去离子水冲洗2~3次→双蒸水冲洗2~3次→晾干→包口→备用;滤器、瓶→自来水冲洗30min→去离子水冲洗→双蒸水冲洗→晾干→备用。

 

三、细胞污染时培养瓶及培养箱的处理:

1、细胞污染   细菌污染时培养基多出现浑浊,在镜下观察时多出现黑色跳动小点。真菌多为霉菌污染时,初期为镜下可见圆形漂浮或贴辅的空心圆泡,后期可见明显霉斑,镜下可见菌丝为树枝状。

2、处理:细菌多用新洁尔灭(20mL/1000mL水)可适当加大浓度,浸泡24h以上;真菌多用过氧乙酸(20mL/10000mL水)可适当加大浓度,浸泡24h以上。

3、培养箱处理:培养箱应拆下内部组件,彻底清洗,用过氧乙酸擦拭后再用新洁尔灭擦拭,然后用酒精擦拭,紫外照射30min,最后用75%的酒精(40℃,CO2为零)培养箱内部熏蒸3~4h;污染严重时要将其放入烘箱内100~200℃烘3~4h安装后再照紫外。

4、培养间处理:要彻底打扫,擦拭,先用0.5%过氧乙酸擦一遍,大约10min后,用0.5%新洁尔灭再擦一遍,最后用过氧乙酸熏蒸消毒。方法为:向熏蒸槽内加入适量酒精,放上石棉网,取一个烧杯,加入100mL过氧乙酸和等量的蒸馏水,把烧杯放在石棉网,一起端进无菌室,并打开室内所有厨子和抽屉,点燃酒精开始熏蒸,中途可以检查酒精燃烧情况,如燃完可以视过氧乙酸剩余多少,再加入适量酒精,切忌烧干过氧乙酸。

 

四、其他注意事项:

1、进出无菌间,无论什么事,都必须带一次性手套开门。

2、血清、双抗等不能照紫外的试剂,直接带进无菌间后用酒精棉球擦拭三遍。

3、无菌间内装消毒液的桶、盆必须专用。

4、所用抹布,在做完实验后要洗涤、高压灭菌,烘干后照紫外,从传递柜带进无菌间,所有能灭菌的物品均以此方式处理。

5 、-70℃冰箱及液氮室钥匙由专人负责,除特殊情况,任何人不得随意拿用;平时也要先跟负责人请示。

6、实验操作分组时,各组使用各组的仪器设备,能分开用的要彻底分开。

7、为提高实验操作人员的关注程度,试验的每个步骤都要有相关纪录。

8、无论实验室有无污染,均要定期熏蒸,夏天一天一次,每次不必太长时间。

9、实验中遇到问题先查书、再找专家,切记勿盲目轻信。

10、在配制试剂时所用的水为去离子、三重蒸馏水,现用现制。

11、实验室内的试剂、相关工具等均有相应摆放位置,勿乱放,并按规定做好定期更新。

12、实验室内禁止带入任何食品。

13、在包滤器、滤瓶时,要包口,包一层牛皮纸之后,外面再包一层布,避免高压灭菌后进入过多水蒸汽。