1. DNA提取
全血DNA提取为例。
1.1血液采集
采全血2mL注入已加入200μL 5%的EDTA抗凝剂的洁净试管中。
1.2 RBC裂解
上述试管中再加入4-5倍体积的RBC裂解液,充分裂解。1000r/min,10分钟。弃去上清液。将WBC扣吸入1.5mL离心管中,加入裂解液再裂解2-3次。
1.3 DNA提取
根据WBC量的多少加入如下试剂:
表1 DNA提取试剂比例表
白细胞量(μL) | ddH2O(μL) | 7.5M胍盐酸(μL) | 10mg/mLPK(μL) | 10%SDS(μL) | 总体积(μL) |
<20 | 300 | 150 | 15 | 150 | 615 |
20-35 | 400 | 175 | 20 | 175 | 770 |
35-50 | 500 | 200 | 25 | 200 | 925 |
50-65 | 600 | 225 | 30 | 225 | 1080 |
65-75 | 700 | 250 | 35 | 250 | 1235 |
76-95 | 800 | 300 | 40 | 300 | 1440 |
注:如果PK的浓度为100mg/mL,则PK的加入量是上表中的十分之一,同时ddH2O的加入量扩大一倍;如果PK的浓度是20mg/mL,则PK的加入量是上一表中的一半,同时ddH2O的加入量应增加保持总体积不变。
将离心管放入70℃水浴中,10 min,充分混匀,然后在70℃水浴中放置15min。
高速离心4 min,将上倒入洁净的试管中,弃去离心管中沉淀物。在试管中加入2-3倍体积的无水乙醇,封口,轻轻混匀至DNA絮状出现。
将提出的DNA吸入1.5mL离心管中,加入70%的乙醇洗涤,高速离心2 min,弃去上清液,重复2-3次,弃乙醇,在无菌操作台中吹干,将DNA溶于100μL ~200μL 的TE中。
2. 琼脂糖电泳及检测
用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上;
调整好梳子的高度;
称取0.25 g琼脂糖于25 ml 1×TAE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至45-50 ℃时加入0.5 ug/ml的溴化乙锭(EB)溶液或以1:10,000的比例加入GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain,加入之后立马摇匀倒入制胶板中;
凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带;
将电泳样品与10× loading Buffer或6× loading Buffer混合后将样品依次点入加样孔中(电泳样品 5 ul+loading Buffer 3 ul共8 ul混匀);
将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动;
电泳完成后切断电源;
取出凝胶,置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。具体见“美国BIORAD凝胶成像基本操作流程”。