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标准化流程与成功技术案例

常规DNA提取及检测

发布时间:2017-06-30 16:45:54    阅读次数:1745  

1.      DNA提取

 全血DNA提取为例。

1.1血液采集

采全血2mL注入已加入200μL 5%的EDTA抗凝剂的洁净试管中。

1.2 RBC裂解

上述试管中再加入4-5倍体积的RBC裂解液,充分裂解。1000r/min,10分钟。弃去上清液。将WBC扣吸入1.5mL离心管中,加入裂解液再裂解2-3次。

1.3 DNA提取

    根据WBC量的多少加入如下试剂:

表1 DNA提取试剂比例表

白细胞量(μL)

ddH2O(μL)

7.5M胍盐酸(μL)

10mg/mLPK(μL)

10%SDS(μL)

总体积(μL)

<20

300

150

15

150

615

20-35

400

175

20

175

770

35-50

500

200

25

200

925

50-65

600

225

30

225

1080

65-75

700

250

35

250

1235

76-95

800

300

40

300

1440

  注:如果PK的浓度为100mg/mL,则PK的加入量是上表中的十分之一,同时ddH2O的加入量扩大一倍;如果PK的浓度是20mg/mL,则PK的加入量是上一表中的一半,同时ddH2O的加入量应增加保持总体积不变。

将离心管放入70℃水浴中,10 min,充分混匀,然后在70℃水浴中放置15min。

高速离心4 min,将上倒入洁净的试管中,弃去离心管中沉淀物。在试管中加入2-3倍体积的无水乙醇,封口,轻轻混匀至DNA絮状出现。

将提出的DNA吸入1.5mL离心管中,加入70%的乙醇洗涤,高速离心2 min,弃去上清液,重复2-3次,弃乙醇,在无菌操作台中吹干,将DNA溶于100μL ~200μL 的TE中。

2.      琼脂糖电泳及检测

用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上;

调整好梳子的高度;

称取0.25 g琼脂糖于25 ml 1×TAE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至45-50 ℃时加入0.5 ug/ml的溴化乙锭(EB)溶液或以1:10,000的比例加入GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain,加入之后立马摇匀倒入制胶板中;

凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带;

将电泳样品与10× loading Buffer或6× loading Buffer混合后将样品依次点入加样孔中(电泳样品 5 ul+loading Buffer 3 ul共8 ul混匀);

将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动;

电泳完成后切断电源;

取出凝胶,置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。具体见“美国BIORAD凝胶成像基本操作流程”。