1. RNA提取

1.1 细胞裂解或组织匀浆。

1.1.1 贴壁细胞：吸尽培养液，每10 cm²细胞加入1 mL Beyozol。一般六孔板每孔加1mL，12孔板每孔加 0.5mL。晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。

1.1.2悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1 mL Beyozol。用枪吹打或适当vortex确保全部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。

1.1.3 组织：先将新鲜组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内，冰浴，加入适量Beyozol，匀浆。冻存组织需放入液氮研磨成粉末，加入适量Beyozol。每50mg-80mg组织加入1mL Beyozol。

1.2对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，Beyozol 裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。需12,000×g 4℃ 离心10min，然后吸取澄清的Beyozol裂解产物至一新的离心管中。

1.3 室温放置5min，使样品充分裂解。

1.4 每毫升Beyozol加入0.2mL氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15s，室温放置2-3min。

1.5 12,000×g 4℃离心15min，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升Beyozol约可吸取0.5-0.55mL。

1.6 按每毫升最初的Beyozol加入0.5mL异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10min。

1.7 12,000×g 4℃离心10min，在管底可见胶状RNA沉淀，弃上清。

1.8 每毫升最初的Beyozol加入1mL75%乙醇，vortex或颠倒混匀，

1.9 7,500×g 4℃离心5min，弃上清。再用离心机甩一下（>5,000rpm, 离心1s），小心吸尽液体。

1.10待RNA略干后，加入20微升DEPC水溶解，-70℃冻存。注意，切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6。

1.11注意事项：

所有离心管，枪头及相关溶液都必需无 RNA酶污染。耐高温器物可 150℃烘烤4h以除去 RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑蒸水用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用 DEPC水配制。加0.01% (体积比) diethylpyrocarbonate（DEPC）至重或MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水。

必需戴无尘一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。

Beyozol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触 Beyozol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。

需自备氯仿，异丙醇，75%乙醇（DEPC水配制），和DEPC水。

Beyozol抽提总RNA的同时，理论上也可抽提蛋白和DNA，但尚未经测试。有兴趣者可按Trizol的操作步骤进行操作。

具体试验方法亦可参考各自RNA提取试剂盒。

2.  RNA质量检测

2.1 紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。使用仪器为天根微量分光光度计，操作详见“TGem Spectrophotometer 超微量分光光度计（OSE-260）操作流程”。

纯度检测：RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2.2 变性琼脂糖凝胶电泳测定

制胶：1g琼脂糖溶于适量TAB缓冲液中，微波炉加热至完全融化，冷却至60℃，加入EB，灌制凝胶板，胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×TAB电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

RNA样品处理：取3μL RNA样品，加3倍体积的甲醛上样染液，变性15min，上样。

电泳：上样前凝胶需预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。

观察并拍照：具体操作流程见“美国BIORAD凝胶成像基本操作流程”。

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

3. cDNA合成

样品cDNA合成，一般根据cDNA转录试剂盒操作步骤完成后，cDNA备用。

参考流程如下：反应体系，包括逆转录buffer、上游引物、下游引物、dNTP、逆转录酶MMLV、DEPC水和RNA模版根据要求混匀，瞬时离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μL，37℃水浴60min。取出后立即95℃干浴3min，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。