一.免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 ：

(1) 石蜡切片脱蜡至水。

(2) 3%H ₂ O ₂室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

(3) 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5分钟×2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

(4) 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37 ℃孵育1-2小时或4℃过夜。

(5) PBS冲洗，5分钟×3 次。

(6) 滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃ 孵育30 分钟。

(7) PBS 冲洗，5 分钟 ×3 次。

(8) 滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 分钟。

(9) PBS 冲洗，5分钟×3 次。

(10) 显色剂显色 3-15 分钟（DAB或NBT/BCIP ）

(11) 自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

二. 冰冻切片免疫组化染色步骤：

   冰冻切片 4-8μm ，放置-20℃备用，PBS洗，5分钟×3次，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。以下同石蜡切片免疫组化。