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标准化流程与成功技术案例

肌肉总蛋白双向电泳体系的建立

发布时间:2019-01-07 15:19:01    阅读次数:15656  

试验方法

1 仪器设备

本试验双向电泳设备为 GE 公司双向电泳系统,主要包括:Ettan IPGphor3 等电聚焦仪、EPS 601 电泳仪、EttanTM DALTsix 垂直电泳槽、image ScannerIII凝胶成像仪和 imageMasterplatinum7.0 凝胶软件分析系统等。

2 试验分组

本试验选取两种规格的胶条:18cm(pH4~7)和24 cm(pH3~10);上样浓度为0.35mg/mL 和 0.7mg/mL 两个浓度,胶条聚焦电压分别为25000Vhr 和 35000Vhr,对试验条件进行优化。

3 第一向等电聚焦

第一向等点聚焦电泳上样,采用主动水化 30 V、13 h,聚焦电压上升采用梯度上升的方式,聚焦强度设置两个程序,第一个程序聚焦强度为 30000Vhr,第二个程序聚焦强度为 50000Vhr。

4 胶条平衡

第一向等点聚焦结束后,IPG 胶条平衡 2 次,每次15 min,严格控制时间。第一不平衡液包括 6 M 尿素、30%甘油和 2.5%的 IAA;第二次平衡液包括 6 M 尿素、30%甘油和 2.5%的 IAA1%DTT。

5第二向 SDS-PAGE

电泳根据样品特点选取凝胶浓度为12.5%,设置电泳程序为,第一阶段:1w/GEL,1h;第二阶段:13 w/GEL,4~5 h,溴酚蓝指示剂至胶板底部,电泳完成。

6 染色

本试验选取的为硝酸银染色,可兼容质谱分析,染色过程共包括固定、敏化、漂洗、银染、漂洗、显色、终止、漂洗几个阶段,使用的主要试剂为冰乙酸、甲醇、甲醛、硝酸银、EDTA、碳酸钠、硫代硫酸钠等,染色过程中所有试剂为分析纯,水质为超纯水。

7图片采集

使用ImageScannerⅢ进行凝胶图片扫描,并保存。

8 ImageMaster 7.0软件图像分析双向电泳

试验的分析使用 ImageMaster 7.0 图像分析软件进行凝胶分析。

试验结果

1 蛋白浓度测定

本试验使用 GE公司2D-Quant蛋白质定量试剂盒进行准确定量(见图1),

公式如下:y=-0.006 1x+0.2825,R2=0.9849。

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2 试验条件优化

通过对双向电泳的条件进行优化,包括蛋白质上样量、IPG胶条pH值和长度、双向电泳和等电聚焦程序等(见图2)。

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3 优化体系的建立

成功的建立了适合獭兔腿部肌肉蛋白质分离的双向电泳体系:SDS-PAGE浓度为12.5%,IPG胶条为24 cm和pH3~10,聚焦强度为60000 Vhr,上样量为247.5μg;采用主动上样方式,电压30V,时间13h,聚焦电压6000V,聚焦强度60000Vhr。

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