试验方法

1 仪器设备

本试验双向电泳设备为 GE 公司双向电泳系统，主要包括：Ettan IPGphor3 等电聚焦仪、EPS 601 电泳仪、EttanTM DALTsix 垂直电泳槽、image ScannerIII凝胶成像仪和 imageMasterplatinum7.0 凝胶软件分析系统等。

2 试验分组

本试验选取两种规格的胶条：18cm(pH4~7)和24 cm(pH3~10)；上样浓度为0.35mg/mL 和 0.7mg/mL 两个浓度，胶条聚焦电压分别为25000Vhr 和 35000Vhr，对试验条件进行优化。

3 第一向等电聚焦

第一向等点聚焦电泳上样，采用主动水化 30 V、13 h，聚焦电压上升采用梯度上升的方式，聚焦强度设置两个程序，第一个程序聚焦强度为 30000Vhr，第二个程序聚焦强度为 50000Vhr。

4 胶条平衡

第一向等点聚焦结束后，IPG 胶条平衡 2 次，每次15 min，严格控制时间。第一不平衡液包括 6 M 尿素、30%甘油和 2.5%的 IAA；第二次平衡液包括 6 M 尿素、30%甘油和 2.5%的 IAA1%DTT。

5第二向 SDS-PAGE

电泳根据样品特点选取凝胶浓度为12.5%，设置电泳程序为，第一阶段：1w/GEL，1h；第二阶段：13 w/GEL，4~5 h，溴酚蓝指示剂至胶板底部，电泳完成。

6 染色

本试验选取的为硝酸银染色，可兼容质谱分析，染色过程共包括固定、敏化、漂洗、银染、漂洗、显色、终止、漂洗几个阶段，使用的主要试剂为冰乙酸、甲醇、甲醛、硝酸银、EDTA、碳酸钠、硫代硫酸钠等，染色过程中所有试剂为分析纯，水质为超纯水。

7图片采集

使用ImageScannerⅢ进行凝胶图片扫描，并保存。

8 ImageMaster 7.0软件图像分析双向电泳

试验的分析使用 ImageMaster 7.0 图像分析软件进行凝胶分析。

试验结果

1 蛋白浓度测定

本试验使用 GE公司2D-Quant蛋白质定量试剂盒进行准确定量（见图1），

公式如下：y=-0.006 1x+0.2825，R²=0.9849。

2 试验条件优化

通过对双向电泳的条件进行优化，包括蛋白质上样量、IPG胶条pH值和长度、双向电泳和等电聚焦程序等（见图2）。

3 优化体系的建立

成功的建立了适合獭兔腿部肌肉蛋白质分离的双向电泳体系：SDS-PAGE浓度为12.5%，IPG胶条为24 cm和pH3~10，聚焦强度为60000 Vhr，上样量为247.5μg；采用主动上样方式，电压30V，时间13h，聚焦电压6000V，聚焦强度60000Vhr。

                                   生命科学研究中心分子生物学平台宣