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标准化流程与成功技术案例

qRT-PCR 实验标准化流程

发布时间:2020-12-24 15:15:16    阅读次数:20938  

1. qRT-PCR实验介绍

1.1 实验原理

实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-time PCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

1.2 特点

实时、定量、荧光

2. Western Blot实验步骤

2.1 荧光定量PCR仪器 ABI-7300

PCR7.png

2.2 相对定量(需要内参基因)

2.2.1  染料法原理:

SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位

SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光

PCR标准化3.png

2.2.2 按照体系加入PCR反应

PCR标准化4.png

2.2.3 获得扩增曲线和熔解曲线

PCR标准化5.png      PCR标准化6.png

2.2.4 数据分析

Ct值数据处理

以一个基因的不同时间点表达为例,如下表结果

每个点获得平均值和方差,做柱形图。

PCR标准化1.png

PCR标准化2.png