实验一细胞传代培养
实验目的:传代培养细胞株
实验原理:
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，培养细胞发生密度抑制以及接触抑制，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
实验试剂与材料:
1.试剂:培养基(DMEM或RPMI1640)，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS缓冲液，75%酒精。
2.实验仪器和材料:CO,培养箱，倒置显微镜，超净台，微量移液器，离心机;培养瓶，吸管，废液缸，离心管，移液器枪头;75%酒精棉球，酒精灯，培养细胞。
实验步骤:
1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手，
2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数
3.将实验所需培养基、胰酶以及 PBS 置 37 ℃下预热。
4.手在进入超净台前应消毒;超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净
5.打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。
6.将实验所需物品放入超净台(所有东西在进入超净台前需用75%酒精消毒)点燃酒精灯。
7.将培养基瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
8.倒掉培养细胞的旧培养基。加入适量的PBS液清洗培养瓶，以除去残留的旧培养基。
9.加入胰酶消化。每个大培养瓶加入1m胰酶，小瓶用量酌减，使瓶底细胞都浸入到酶溶液中。倒置显微镜下观察，细胞变圆时终止消化。一般室温消化时间约为 1-3 min。
10.加入含10%-15%胎牛血清的培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，转移至离心管中，1000rs离心5min后弃上清液。加入2ml的新鲜培养基吹打均匀后分装到新培养瓶中，加适量的培养基。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO,气体的进入，在培养瓶上标记好放回COz培养箱。
11.对悬浮培养细胞，步骤8-10不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
注意事项:
1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量近酒精灯火焰;每次最好只进行一种细胞的操作;每一种细胞使用一套器材:培养用液应严格分开。
2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，并对养环境做相应的处理。
4.掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。5.掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。
实验二细胞原代培养(分散细胞培养)
实验目的:培养原代细胞
实验原理:
原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后,经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下,生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分,生长缓慢但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。实验试剂与材料:
1.试剂:培养基(DMEM或RPMI1640)，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS缓冲液，D-Hanks缓冲液，75%酒精。
2.实验仪器和材料:COz培养箱，倒置显微镜，超净台，微量移液器，离心机培养瓶，平皿，吸管，废液缸，离心管，烧杯，移液器枪头;75%酒精棉球,酒精灯，培养细胞。镊子，止血钳，剪刀，筛网，小鼠等。
实验步骤:
1.实验准备:超净台紫外线消毒20min，将已灭菌的各种实验所需物品放入。开始操作前吸收，75%酒精擦拭手部。
2.剪取组织:颈椎脱臼法处死小鼠，把整只鼠置于75%酒精中浸泡消毒3min。
取出小鼠，打开腹腔，取出脏器(肾、肝、脾等)。
3.清洗:把取出的脏器放入平皿中，用PBS洗涤数次，剔除包膜以及结缔组织，然后将剔除后的脏器放入另一盛有PBS的平皿中。
4.剪切:将脏器剪成0.5-1mm?大小的组织块，再次用PBS清洗去残留血细胞5.消化:加入比组织块总量2-3倍的胰酶,置于37 ℃温箱中消化，消化过程中每隔 20 min摇动一次。消化时间依据组织块大小和组织硬度而定。
6.分离:待组织分散成细胞团或单细胞时终止消化，使用适宜的网过滤掉尚未完全消化的组织块。800g离心5min，PBS洗两次，加入含有血清的培养液计数。
7.培养:根据计数结果，补加培养液，分装如培养瓶中，置于CO,培养箱中培养。
注意事项:
1.无菌操作:细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。
2.培养液:所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
3.胎牛血清:血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。
4.酶溶液:必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20 ℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。
5.L-谷氨酰胺:几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。
6.静置培养:原代细胞在消化分离后，置于C0培养箱的头24~48h(必要时72h)内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖。不必担心培养液中的营养成分会消耗光，在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。
7.消化时间:一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤加重细胞培养成活率降低。
8.其他生长因子:经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子,如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外，内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用，但费用较高。
实验三细胞原代培养(组织块培养)
实验目的:培养原代组织块
实验原理:
组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上,加入培养基后进行培养。
实验试剂与材料:
1.试剂:培养基(DMEM或RPMI1640)，胎牛血清，0.25%蛋白酶，PBS缓冲液，D-Hanks缓冲液，75%酒精。
2.实验仪器和材料:CO,培养箱，倒置显微镜，超净台，微量移液器，离心机;培养瓶，平皿，吸管，废液缸，离心管，烧杯，移液器枪头;75%酒精棉球,酒精灯。镊子，止血钳，剪刀，小鼠等。
实验步骤:
1.实验准备:超净台紫外线消毒20min，将已灭菌的各种实验所需物品放入。
开始操作前洗手，75%酒精擦拭手部。
2.剪取组织:颈椎脱臼法处死小鼠，把整只鼠置于75%酒精中浸泡消毒3min。
取出小鼠，打开腹腔，取出脏器(肾、肝、脾等)。
3.清洗:把取出的脏器放入平皿中，用PBS洗涤数次，剔除包膜以及结缔组织然后将剔除后的脏器放入另一盛有PBS的平皿中。
4.剪切:将脏器剪成0.5-1mm大小的组织块，加入2滴胎牛血清，吹打均匀，制成悬液。
5.接种:用吸管吸取悬液，将组织块均匀接种在培养瓶底部。
6.培养:翻转培养瓶，使瓶底向上，置于37℃温箱中1小时。再翻转培养瓶加入适量培养液，将培养瓶放入培养箱中培养。
注意事项:
1.整个实验过程要保持所有的组织处于无菌条件
2.器材使用时要火焰消毒，同时，防止烫伤、烫死细胞。
3.吸取溶液的吸管不能混用，以免交叉污染。
实验四细胞冻
实验目的:长期保存细胞株
实验原理:
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。实验试剂与材料:
1.试剂:培养基(DMEM或RPMI1640)，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS缓冲液，D-Hanks缓冲液，75%酒精，二甲基亚砜。
2.实验仪器和材料:CO,培养箱，倒置显微镜，超净台，微量移液器，液氨罐培养瓶，平皿，吸管，废液缸，离心管，烧杯，移液器枪头，细胞冻存管;75%酒精棉球，酒精灯。
实验步骤:
1.实验准备:超净台紫外线消毒20min，将已灭菌的各种实验所需物品放入。
开始操作前洗手，75%酒精擦拭手部。
2.配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液:
3.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、
4.离心1000 rpm,5 min;
5.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5x106/ml~1x107/ml
6.将细胞分装入冻存管中，每管1~1.5 ml;
7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;
8.冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
实验六 细胞复苏
实验目的:将冻存的细胞复苏培养
实验原理:
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保细胞活力。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结品在很短的时间内即融化,避免山于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结品对细胞造成损伤。
实验试剂与材料:
1.试剂:培养基(DMEM或RPMI1640)，胎牛血清，0.25%蛋白酶，PBS缓冲液，D-Hanks 缓冲液，75%酒精。
2.实验仪器和材料:CO,培养箱，倒显微镜，超净台，微移液器，液氮罐培养瓶，平皿，吸管，废液缸，离心管，烧杯，移液器枪头，细胞冻存管:75%酒精棉球，酒精灯。
实验步骤:
1.实验准备:超净台紫外线消毒20min，将已灭菌的各种实验所需物品放入。
开始操作前洗手，75%酒精擦拭手部。
2.从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃水浴中,并不时摇动令其尽快融化3.从37 ℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀;
4.离心，1000 rpm，5 min;
5.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养
6.次日更换一次培养液，继续培养。