1.目的

1.1本SOP规定本平台HPLC法测定小米维生素Ｅ标准操作程序。

1.2本SOP为本平台HPLC法测定小米维生素Ｅ操作手册。

2.范围

2.1实用于本平台HPLC法测定小米维生素Ｅ。

3.责任和要求

3.1为保证检测结果准确无误，实验室操作人员请按此标准程序要求操作。

3.2凡违反此SOP操作程序的检测，将视为无效检验。

4.检测原理

用甲醇提取试料中VE，超声提取，使用高效液相色谱-紫外检测法测定，外标法定量。

5.方法灵敏度

本方法在测定小米维生素Ｅ的检测限均为3µg/g，定量限均为6µg/kg。

6.材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为超纯水。

6.1 VE标准品(α-生育酚) 纯度≥96％

6.2 甲醇 色谱纯

6.3  BHT(2，6-二叔丁基对甲酚)

6.4 抗坏血酸

6.5 氢氧化钾

6.6 三氟乙酸酐

6.7 氯化钠

6.8 正己烷

6.9 乙酸乙酯

6.10无水乙醇

6.11混合标准贮备液：

6.11.1标准母液溶液配制

精确称取100ｍg VE 标准品，用甲醇定容至1000ｍL，配成0.1ｍg/ｍL标准贮备液， -20℃保存，有效期6个月。

6.11.2标准溶液配制

分别精确量取0.5mL、5mL、10mL、25mL、50mL, 母液定容于100mL， 配成质量浓度分别0.5µg/mL、5µg/mL、10µg/mL、25µg/mL、50µg/mL的标准溶液， -20℃保存，有效期1个月。

6.12 高效液相色谱仪（配紫外检测器）

6.13 分析天平 感量0.00001g

6.14 天平 感量0.01g

6.15 N-EVAP型氮吹仪（美国Organomation）

6.16 DigetalD-37520型高速冷冻离心机，德国贺利氏公司

6.17 涡旋混合仪

6.18 聚丙烯离心管 50 mL

6.19 氮吹仪

6.20 四两中药粉碎机

6.21 微孔滤膜 0.45μm

6.22 全温振荡器

7. 检验步骤

7.1 试料的制备

准确称取1g粉碎后小米试样于试管中，分别加入1mg/mL2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)的乙醇溶液10ｍL和10％抗坏血酸溶液1mL，置于超声波清洗器中提取10min后，再加入50％氢氧化钾溶液2mL，并充入氮气封口，然后于70℃振荡器中以200r/ｍin皂化30ｍin（其间在旋涡振荡器上混合数次），取出后置于冰浴中冷却。将冷却后的试样皂化液全部转移至分液漏斗中，加入2％氯化钠溶液20mL，再用10ml正己烷-乙酸乙酯（85/15,V/V）溶液萃取2次。收集2次萃取液的有机相，并在有机相中加人少量无水硫酸钠，然后吸取有机相5ｍL移入试管，在氮吹仪上吹至近干，复溶于lmL甲醇，过0.45μm滤膜后置于HPLC小瓶中上机测定。

7.2 测定

7.2.1色谱条件

7.2.1.1色谱柱：C18柱，（150×4.6 mm，粒径5µm）；或相当者；

7.2.1.2 流动相：甲醇+水（95+5，v/v）；

7.2.1.3 流速：1.0mL/min；

7.2.1.4进样量：20 µL

7.2.1.5 柱温：30℃；

7.2.1.6. 检测器波长280nm

7.3 标准曲线的制备

分别进样0.5µg/mL、5µg/ｍL、10µg/ｍL、25µg/ｍL、50µg/ｍL的维生素E标准品溶液，以对照品峰面积为横坐标（Z）、对照品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

8.结果计算和表述

小米中维生素E（µg/kg），按下式计算：

式中:

X _i——试料中相应的维生素E的含量，µg/kg；

C _i——试样溶液中相应的维生素E的浓度，µg/mL；

V ——上机试样的总体积，mL；

n ——稀释倍数

m ——供试试料的质量，g。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

9. 重复性

在相同重复性条件下进行两次平行，测定结果相对偏差不大于15%。

10.检测记录

10.1所有样本信息、试剂信息及检测实验原始记录须按规范详细、准确记录、存档，相关表格附后。

附 录 A

（资料性附录）

高效液相色谱图

    图.1维生素E(α-生育酚)标准溶液色谱图（50ng/mL）

图2.小米中维生素E(α-生育酚)色谱图（10ng/g）