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标准化流程与成功技术案例

HPLC法测定小米维生素E检测标准操作规程

发布时间:2017-06-30 16:53:54    阅读次数:757  

1.目的

1.1本SOP规定本平台HPLC法测定小米维生素E标准操作程序。

1.2本SOP为本平台HPLC法测定小米维生素E操作手册。

2.范围

2.1实用于本平台HPLC法测定小米维生素E。

3.责任和要求

3.1为保证检测结果准确无误,实验室操作人员请按此标准程序要求操作。

3.2凡违反此SOP操作程序的检测,将视为无效检验。

4.检测原理

用甲醇提取试料中VE,超声提取,使用高效液相色谱-紫外检测法测定,外标法定量。

5.方法灵敏度

本方法在测定小米维生素E的检测限均为3µg/g,定量限均为6µg/kg。

6.材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外,以下所用试剂均为分析纯;水为超纯水。

6.1 VE标准品(α-生育酚) 纯度≥96%

6.2 甲醇 色谱纯

6.3  BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)

6.4 抗坏血酸

6.5 氢氧化钾

6.6 三氟乙酸酐

6.7 氯化钠

6.8 正己烷

6.9 乙酸乙酯

6.10无水乙醇

6.11混合标准贮备液:

6.11.1标准母液溶液配制

精确称取100mg VE 标准品,用甲醇定容至1000mL,配成0.1mg/mL标准贮备液, -20℃保存,有效期6个月。

6.11.2标准溶液配制

分别精确量取0.5mL、5mL、10mL、25mL、50mL, 母液定容于100mL, 配成质量浓度分别0.5µg/mL、5µg/mL、10µg/mL、25µg/mL、50µg/mL的标准溶液, -20℃保存,有效期1个月。

6.12 高效液相色谱仪(配紫外检测器)

6.13 分析天平 感量0.00001g

6.14 天平 感量0.01g

6.15 N-EVAP型氮吹仪(美国Organomation)

6.16 DigetalD-37520型高速冷冻离心机,德国贺利氏公司

6.17 涡旋混合仪

6.18 聚丙烯离心管 50 mL

6.19 氮吹仪

6.20 四两中药粉碎机

6.21 微孔滤膜 0.45μm

6.22 全温振荡器

7. 检验步骤

7.1 试料的制备

准确称取1g粉碎后小米试样于试管中,分别加入1mg/mL2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)的乙醇溶液10mL和10%抗坏血酸溶液1mL,置于超声波清洗器中提取10min后,再加入50%氢氧化钾溶液2mL,并充入氮气封口,然后于70℃振荡器中以200r/min皂化30min(其间在旋涡振荡器上混合数次),取出后置于冰浴中冷却。将冷却后的试样皂化液全部转移至分液漏斗中,加入2%氯化钠溶液20mL,再用10ml正己烷-乙酸乙酯(85/15,V/V)溶液萃取2次。收集2次萃取液的有机相,并在有机相中加人少量无水硫酸钠,然后吸取有机相5mL移入试管,在氮吹仪上吹至近干,复溶于lmL甲醇,过0.45μm滤膜后置于HPLC小瓶中上机测定。

7.2 测定

7.2.1色谱条件

7.2.1.1色谱柱:C18柱,(150×4.6 mm,粒径5µm);或相当者;

7.2.1.2 流动相:甲醇+水(95+5,v/v);

7.2.1.3 流速:1.0mL/min;

7.2.1.4进样量:20 µL

7.2.1.5 柱温:30℃;

7.2.1.6. 检测器波长280nm

7.3 标准曲线的制备

分别进样0.5µg/mL、5µg/mL、10µg/mL、25µg/mL、50µg/mL的维生素E标准品溶液,以对照品峰面积为横坐标(Z)、对照品浓度为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程。

8.结果计算和表述

小米中维生素E(µg/kg),按下式计算:

式中:

X i——试料中相应的维生素E的含量,µg/kg;

C i——试样溶液中相应的维生素E的浓度,µg/mL;

V ——上机试样的总体积,mL;

n ——稀释倍数

m ——供试试料的质量,g。

注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留三位有效数字。

9. 重复性

在相同重复性条件下进行两次平行,测定结果相对偏差不大于15%。

10.检测记录

10.1所有样本信息、试剂信息及检测实验原始记录须按规范详细、准确记录、存档,相关表格附后。

附 录 A

(资料性附录)

高效液相色谱图

    图.1维生素E(α-生育酚)标准溶液色谱图(50ng/mL)


图2.小米中维生素E(α-生育酚)色谱图(10ng/g)